RELAZIONE CONCLUSIVA DELL’ ATTIVITA’ DI LABORATORIO DEL GERMOPLASMA DELLA COMUNITÀ MONTANA VALNERINA (1999-2001).

Le attività di lavoro sono state organizzate considerando il periodo di disponibilità delle piante e considerando i progressi ottenuti in laboratorio nelle fasi di stabilizzazione, proliferazione e radicazione; le suddette fasi si sono ripetute per tutte le specie con la seguente modalità:

- ricerca di materiale vegetale, per la collezione ex situ del laboratorio;

- reperimento di piante spontanee, incluse nella lista di specie da porre sotto sperimentazione;

- ricerca del miglior espianto vegetale da utilizzare per la messa in coltura;

- individuazione del terreno più adatto per l’avvio delle colture asettiche;

- ricerca dei migliori substrati di moltiplicazione e di radicazione delle specie;

In molti casi la disponibilità di specie vegetali in prossimità del laboratorio ha facilitato alquanto le fasi riguardanti la ricerca di protocolli di sterilizzazione e messa in coltura, potendo raccogliere settimanalmente espianti freschi. In altri casi si é ricorso al prelievo di piante con l’apparato radicale intero, che successivamente sono state travasate in vasi con terriccio per il mantenimento. Per le specie arboree si sono prelevati dei rami nel periodo di riposo e conservati in frigorifero a 4 C° per mantenere uno stock di gemme pronte per la sterilizzazione o per avere disponibili dei rami da far germogliare in laboratorio e per successivamente prelevare i germogli.

Allestimento di una collezione di piante per il germoplasma appenninico, con particolare riferimento alle piante ornamentali selvatiche reperibili in zona.

Durante il periodo marzo - agosto 1999, sono state raccolte una settantina di specie erbacee ed arbustive spontanee della zona. Le piante nella fattispecie sono state raccolte sulla piana del Castelluccio, a Gavelli, in località Castel San Felice e lungo la Valnerina nel comune di Cerreto di Spoleto. Tali piante, raccolte con il loro pane di terra, sono state mantenute in vasi di plastica in prossimità del laboratorio.

La finalità di questa raccolta era prevalentemente quella di avere un controllo diretto sugli stadi fonologici delle piante spontanee, nonché di avere la possibilità di mostrare quale fosse la flora più pregevole del sottobosco dell’ appennino centrale umbro. Tra le specie raccolte (la lista completa é in allegato) si annoverano alcune della flora protetta italiana. La raccolta ha il significato di mantenere i genotipi protetti e moltiplicarli per vaia naturale, vegetativa o tramite la coltura in vitro al fine di diffonderli, proteggendo le popolazioni naturali da prelievi indiscriminati.

Di un certo numero Crocus, Antericum, Aspholdeline, Muscari, Primula, Ranuncolo si é provveduto alla raccolta dei semi prodotti dalle piante, che sono stati in parte utilizzati per verificarne la vitalità e la possibilità di coltivazione su substrato artificiale in vitro.

Alcuni successi parziali sono stati ottenuti con Anthericum lilago e Asphodeline lutea, ma solamente con le semine primaverili sarà possibile avere un’indicazione certa sull’utilizzabilità dei semi di queste specie.

Di altre specie dotate di bulbi sarà tentata la propagazione agamica.

Per la costituzione della Collezione del Germoplasma presso il Laboratorio di Colture in vitro, sì è dato avvio alla fase di sperimentazione per la messa a punto dei protocolli di propagazione idonei ai singoli genotipi, di cui, di seguito, sarà data descrizione.

Tutte le operazioni di manipolazione del materiale vegetale coltivato in vitro sono state condotte in condizioni di asepsi.

I terreni nutritivi, solidificati con agar-agar (0,7%), sono stati resi sterili mediante permanenza in autoclave alla temperatura di 115°C per 20 minuti, dopo essere stati tamponati a pH 5,8.

Le colture sono state allevate in camera di crescita caratterizzata da fotoperiodo di giorno lungo (16 ore di luce e 8 di buio), con intensità luminosa pari a 40 µEm^-2s^-1.

1. Scotano

Scheda Botanica:

Cotinus coccigira L. (Anacardiacee). Arborescello alto 1-5 metri, con foglie semplici, glabre su ambedue le facce, ovali arrotondate, ottuse ed intere. I fiori appaiono in maggio giugno e sono ermafroditi o in parte unisessuali maschili, dotati di petali verde - giallognoli, le drupe sono piccole obovali glabre rosso brune e lucenti. Cresce in luoghi aridi e sassosi. Si distingue per la variegata colorazione delle foglie in autunno.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Drupe dell’anno precedente e rami quiescenti da piante prelevate sulla forchetta di Ancarano in marzo.

- Rametti in crescita attiva prelevati in giugno luglio in località Castel San Felice.

- Drupe dell’anno prelevata in agosto in località Castel San Felice.

Metodologie di sterilizzazione

a) le drupe sono state lavate sotto acqua corrente e strofinate tra le dita al fine di eliminare tutti i residui fiorali ed eventuali particelle di polvere; i semi sono stati, quindi, posti in acqua distillata e Tween in agitazione per almeno 12 ore. Successivamente sono stati sciacquati in acqua distillata, lavati in alcool al 70% per due minuti e posti in una soluzione al 2% di NaOCl ed una goccia di Tween 20 per 30 minuti, in continua agitazione, lavati in acqua distillata sterile per due volte e lasciati in immersione per due ore per permettere il rilascio di eventuali sostanze tossiche.

Tutto il materiale è stato posto su terreno di germinazione composto da MS (sali e vitamine), arricchito di saccarosio (3%) ed addensato con 6 grammi/litro di agar. Nel tempo non sono state osservate germinazioni, mentre alcuni semi risultavano essere inquinati. Un campione di semi prelevati in agosto sulla strada per il Castelluccio sono stati mantenuti in frigorifero per una eventuale semina primaverile.

b) i rametti invernali sono stati raccolti e disinfettati con un fungicida commerciale, asciugati e posti in sacchetti di polietilene per la conservazione in frigorifero a 4C°. Ne è seguita la sterilizzazione, previo lavaggio in acqua per due ore, che si è articolata in una prima immersione di un minuto in alcool 70% e successivamente per 20 minuti in ipoclorito di sodio al 2%, seguite da tre risciacqui in acqua sterile. Tuttavia non è stata conseguita soddisfacente sterilizzazione del materiale, a causa di batteriosi endogene.

c) I rami dell’anno di circa10 – 20 cm di lunghezza e di consistenza ancora erbacea sono stati raccolti e posti direttamente in una soluzione al 0,1 % di acido ascorbico per 60 minuti; sono stati, successivamente, privati delle foglie e tagliati in segmenti contenenti due nodi, che sono stati sottoposti a sterilizzazione, attraverso una breve immersione in alcool 70% e, di seguito, in soluzione all’ 1% di ipoclorito di sodio per 5 minuti; sono seguiti, quindi, tre risciacqui in acqua sterile. I segmenti sono stati privati delle parti più esterne danneggiate dal cloro e posti in tubi di vetro con 10 ml di WPM, addizionato di zucchero (3%) e di 2 ml/l di PPM e 6 grammi di agar. La percentuale di successo di sterilizzazione è stata molto alta anche in virtù della presenza del PPM.

Alcuni espianti si sono sviluppati occupando tutta la lunghezza del tubo e le gemme ascellari al di sotto della gemma apicale, una volta trovatesi senza l’effetto di dominanza apicale, hanno iniziato a svilupparsi. Tali espianti sono stati mantenuti su questo terreno per almeno 30 giorni prima di essere sottoposti a trattamenti ormonali, al fine di favorire la proliferazione dei germogli.

Proliferazione

Considerando la natura arborea della specie, si è preferito procedere esclusivamente con il terreno di base Woody Plant Meduim (WPM), addizionato del 3% di saccarosio per le successive fasi di moltiplicazione e di radicazione. Tra le varie combinazioni ormonali sono stati provati i seguenti ormoni: IAA (acidi indolacetico) 0,2 e 0,5 mg/l; BAP (Benzil amino purina) 0,2 e 0,5 mg/l. I migliori risultati sono stati osservati in presenza dell’auxina alla concentrazione di 0,2 mg/l: a questa concentrazione i germogli si sviluppavano in maniera ottimale, mentre alle altre risultavano bloccati o addirittura degeneravano.

L’aspetto delle piantine in vitro mostrava foglioline molto piccole e rotondeggianti, fusti esili ed erbacei internodi assai ridotti.

Dopo un ciclo di crescita a queste condizioni i germogli che si erano allungati maggiormente sono stati tagliati per verificare la loro capacita’ moltiplicativa.

Successivamente si è proceduto al tentativo di ottimizzare l’attività vegetativa degli espianti in proliferazione, correggendo la componente ormonale mediante l’aggiunta di 0,2 mg/l di BAP, con l’obiettivo di indurre una maggiore moltiplicazione cellulare. Il coefficiente di moltiplicazione rilevato è risultato pari a 3.

Radicazione

La presenza della componente auxinica consente, durante la medesima proliferazione, l’emissione di radici. Tuttavia, si ritengono necessari ulteriori ricerche, volte, se possibile, a mettere a punto un protocollo che consenta di separare l’attività vegetativa da quella rizogena in due fasi distinte, in modo da ottimizzare l’efficienza produttiva dei germogli e la capacità di questi di emettere radici.

2. Corniolo

Scheda Botanica

Cornus mas L. (Cornacee) Arborescello, con foglie semplici, opposte ellittiche senza stipule. I fiori appaiono in febbraio aprile e sono ermafroditi, dotati di petali gialli; le drupe sono oblunghe rosse, dotate di un nocciolo a 4 logge, monosperme. È presente nei boschi e siepi di tutta la penisola.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Rami quiescenti da piante prelevate sulla strada per Gavelli in marzo.

- Rametti in crescita attiva prelevati in giugno luglio in località Castel San Felice.

- Drupe dell’anno prelevate in settembre in località Castel San Felice.

Metodologie di sterilizzazione

a) Le drupe sono state immerse in acido cloridrico per 4 ore e successivamente immerse in acqua, liberate della polpa, lavate sotto acqua corrente e strofinate tra le dita al fine di eliminare tutti i residui della polpa sono state, quindi, poste in acqua distillata e Tween in agitazione per almeno 12 ore. Successivamente i semi sono stati sciacquati in acqua distillata, lavati in alcool al 70% per due minuti e posti in una soluzione al 2% di NaOCl ed una goccia di Tween 20 per 30 minuti in continua agitazione; infine sono stati lavati in acqua distillata sterile.

I semi sono stati posti su terreno di germinazione composto da MS (sali e vitamine) 3% di zucchero ed addensato con 6 grammi di agar. Nel tempo non si sono mai osservate delle germinazioni, né contaminazioni alcuni semi sono stati posti a 4C° per rompere un eventuale dormienza.

b) I rametti invernali sono stati raccolti e disinfettati con un fungicida commerciale, asciugati e posti in sacchetti di polietilene per la conservazione in frigorifero a 4C°, sottoposti a sterilizzazione previo lavaggio: in acqua per due ore, un minuto in alcool 70%, 20 minuti in una soluzione di NaOCl al 2%. Quindi sono stati sciacquati tre volte in acqua sterile. Tuttavia la presenza di infezioni fungine si evidenziava anche variando i tempi e ponendo gli espianti sotto vuoto.

c) I rami dell’anno di circa 20 cm di lunghezza venivano raccolti e posti direttamente in una soluzione con 100 mg/l di acido ascorbico in acqua distillata per una o due ore; venivano poi privati delle foglie già espanse lasciando un tronco di picciolo e tagliati in segmenti contenenti due nodi e sottoposti a sterilizzazione, che venivano sottoposti ad immersione in alcool 70% e poi per 5 minuti in una soluzione al 1% di ipoclorito di sodio; si effettuavano infine tre sciacqui in acqua sterile. Successivamente i segmenti venivano privati delle parti più esterne danneggiate dal cloro e posti in tubi di vetro con 10 ml di WPM, caratterizzato dall’aggiunta di 3% di zucchero, 2 ml di PPM e 6 grammi di agar. La percentuale di successo di sterilizzazione è stata molto alta anche in virtù del fatto che il PPM ha svolto la sua funzione sterilizzante.

Nel tempo alcuni espianti si sono ricoperti di micelio nella parte più distale dal terreno, ma altri hanno continuato a svilupparsi occupando tutta la lunghezza del tubo e le gemme ascellari, trovatesi senza l’effetto di dominanza apicale, hanno iniziato a svilupparsi. Tali espianti sono stati mantenuti sul terreno, di cui sopra, per almeno 30 giorni prima di essere sottoposti a trattamenti ormonali per favorire la proliferazione dei germogli.

Proliferazione

Considerando la natura arborea della specie si è preferito procedere esclusivamente con il terreno di base Woody Plant Meduim (WPM) con saccarosio al 3% per le successive fasi di moltiplicazione e di radicazione. Delle varie combinazioni ormonali testate, sono stati impiegati IAA (acido idolacetico) 0,2 e 0,5 mg/l e BAP (Benzil amino purina) 0,2 e 0,5 mg/l. I migliori risultati sono stati osservati in presenza della citochinina, alla concentrazione di 0,2 mg/, che induceva una metta tendenza all’accestimento dei germogli.

L’habitus della pianta in vitro si presentava con foglie vitrescenti o iperidriche, internodi assai raccorciati contro i 3-5 cm delle prime fasi di crescita, foglioline quasi lineari e contorte.

3. Pungitopo

Scheda Botanica

Ruscus aculeatus L. (Asparagagee). Piante erbacce perenni a fusto abbondantemente ramificato dotate di foglie (Cladioli) piccole e pungenti. I fiori dioici1-2 sono portati sulla faccia superiore dei cladioli e sono regolari. I frutti sono bacche triloculari con semi globosi a guscio sottile ed embrione minuto, dritto e con albume abbondante e cartilagineo. Presente nei boschi e siepi di tutta la penisola, è considerata specie protetta.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Frutti interi prelevati in Marzo in località Castel San Felice.

- Gemme prelevate dal fusto sotterraneo in Aprile in località Castel San Felice.

Metodologie di sterilizzazione

a) le drupe sono state immerse in una soluzione all’1 % di acido cloridrico per 4 ore e successivamente immerse in acqua e liberate della polpa; una volta lavate sotto acqua corrente, sono state strofinate tra le dita al fine di eliminare tutti i residui della polpa fibrosa. Infine sono state poste in acqua distillata e Tween in agitazione per almeno 1 ora. Successivamente i semi sono stati sciacquati in acqua distillata lavati in alcool al 70% per due minuti, posti in una soluzione al 2% di NaOCl ed una goccia di Tween 20 per 30 minuti un continua agitazione e lavati in acqua distillata sterile. I semi sono stati posti su terreno di germinazione composto da MS (sali e vitamine) 3% di zucchero ed addensato con 6 grammi di agar. Nel tempo non si sono mai osservate delle germinazioni, frequenti invece sono state le contaminazioni fungine.

b) alcune gemme prelevate da un rizoma sotterraneo sono state isolate in primavera poco prima che si avesse la germogliazione delle stesse, sono state isolate e poste in acqua per tre ore pulite di ulteriori parti morte e residui di terra, sciacquati in alcool 70% per un minuto, 20 minuti in NaOCl e lasciate in acqua sterile per 1-2 ore. I meristemi, prelevati asportando le parti più esterne delle gemme posti su terremo di germinazione MS30 senza ormoni, non si sono sviluppati.

c) una terza tecnica ha previsto il pretrattamento delle bacche fino all’eliminazione della polpa, seguita da una presterilizzazione per 3 ore in NaOCl 1%, a cui si faceva seguito una normale sterilizzazione per 2 min. in alcool 70%, 20 minuti in NaOCl 2% e tre risciacqui in acqua. I semi cosi ottenuti venivano sezionati per l’estrazione dell’embrione, facendo attenzione a non danneggiare il medesimo, seguiva il posizionamento su terreno MS, addizionato del 3% di zucchero e 6 grammi di agar. Nelle sei settimane successive gli embrioni si sviluppavano dando luogo a due cotiledoni ben estesi, un apparato radicale ed un germoglio. Successivamente questo veniva prelevato assieme alla parte più basale dell’asse cotiledonare e posto su terreno di proliferazione. Non si sono mai osservati inquinamenti di sorta e tutti gli embrioni hanno germogliato.

Proliferazione

Considerando la natura erbacea della specie si è preferito procedere esclusivamente con il terreno di base Murashige & Skoog (MS), addizionato del 3% di saccarosio e di 0,2 - 0,5 mg/l BAP (benzil amino purina), 0,1 mg/l di GA3 (acido gibberellico) o 0,5 mg/l di NAA (acido naphtalen acetico). I migliori risultati sono stati osservati in presenza della citochinina alla concentrazione di 0,5 mg/l, che induceva germogliamento.

Subcolture di 45 giorni (periodo di coltura che intercorre tra l’avvio della proliferazione ed il prelievo dei germogli ottenuti da essa, che possono essere riutilizzati per un ulteriore ciclo di moltiplicazione) hanno consentito di conseguire un coefficiente di moltiplicazione (numero di germogli ottenuti da un espianto iniziale al termine di una subcoltura di proliferazione) pari a circa 2,5.

Radicazione

I germogli vitro-derivati di Ruscus sembrano in grado di emettere spontaneamente radici anche al termine della proliferazione.

Tuttavia si è ritenuto che tale capacità naturale debba essere migliorata, in funzione della produzione di plantule (germogli derivanti dalla coltura in vitro, completi di apparato vegetativo e di radici), quanto più idonee al successivo trapianto in condizioni di ex vitro (acclimatamento o ambientamento).

A tale scopo si è tuttora in fase di verifica di alcuni suggerimenti riportati in letteratura, utilizzando un terreno di radicazione costituito da MS, addizionato di IBA (acido indol butirrico) (quale componente auxinica) alla concentrazione di 2 mg/l) e saccarosio (30 g/l).

Stimolazione di embrioni somatici

Un embrione zigotico isolato da seme ed accidentalmente posto su substrato MS addizionato con 2 mg/L di TDZ Tidiazuron ha prodotto nell’arco di tempo di 60-70 giorni un gran numero di embrioni somatici che, isolati, si sono sviluppati in piantine complete di radici. Tali piantine sono state trattate come le altre. Tale espianto non solo ha la capacità di proliferare in maniera considerevole ma probabilmente dovrebbe rispondere in maniera più pronta ad un eventuale substrato di radicazione, i germogli formati in questo caso non sono mai dotati di apparato radicale.

4. Frassino

Scheda Botanica

Fraxinus exelsior L. (Oleacee). Albero, con foglie composte semplici, da 2 a 6 paia di foglioline sessili acutamente dentate. I fiori poligamo monoici o raramente dioici si sviluppano prima delle foglie. Cresce in boschi freschi e luoghi umidi, spesso è coltivato.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Alcuni rametti con gemme rigonfie prelevate in aprile poco dopo la fioritura, (In località da comunicare) raccolti in sacchetti di polietilene e conservati in frigorifero a 4C°, prima dell’uso sono stati posti in acqua a temperatura ambiente e dopo circa due settimane le gemme hanno prodotto germogli di 1-2 cm di lunghezza, che sono stati prelevati con tutta la base della gemma e sterilizzati.

Metodologie di sterilizzazione

a) I germogli venivano brevemente lavati in acqua distillata con una goccia di Tween 20, immersi per qualche secondo in alcool 70% e successivamente posti in agitazione per 5 minuti in una soluzione al 1% di NaOCl; infine sono stati effetuati tre sciacqui in acqua sterile. Lasciati per un ora in immersione, i segmenti venivano privati delle parte basale e delle foglioline più basali e più estese, e posti in tubi di vetro con 10 ml di WPM, addizionato di zucchero al 3%, 2 ml di PPM e 6 grammi di agar.

La percentuale di successo di sterilizzazione è stata molto alta, anche in virtù’ del fatto che il PPM ha svolto la sua funzione sterilizzante iniziale. In alcuni espianti si sono osservate delle contaminazioni batteriche che potevano essere rimosse eliminando la parte più basale delle espiato e trasferendo su terreno fresco la parte superiore del germoglio. Tali espianti sono stati mantenuti su questo terreno per almeno 30 giorni, prima di essere sottoposti a trattamenti ormonali per favorire la proliferazione dei germogli. Solo due espianti hanno iniziato ad accrescersi a due mesi di distanza dalla sterilizzazione, gli altri sono rimasti a livello di rosetta e sono lentamente degenerati o si sono inquinati nel tempo.

5. Fragolina di bosco

Scheda Botanica

Fragaria vesca L. (Rosacee). Pianta perenne erbacea, con peduncoli, caratterizzata da peli appressati e da foglie composte e dotate di stipule. I fiori appaiono in giugno - settembre e sono caratterizzati da moltissimi pistilli elicati, dotati di petali bianchi, quelli mezzani hanno un diametro di 12-15 mm. Frutto è edule ed aromatico. Cresce in boschi e luoghi erbosi.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Data la disponibilità di frutti maturi si è esclusivamente operato con gli acheni prelevati da piante prelevate o naturali.

Metodologie di sterilizzazione

I talami ben rossi e maturi sono stati schiacciati tre le dita e disciolti in acqua, con aggiunta di un po’ di varechina; questa ha in parte sciolto la polpa del talami e sbiancato i semi, che successivamente sono stati posti ad asciugare su un pezzo di carta al sole. Una volta asciutti i semi sono stati staccati dalla carta a cui aderivano isolandoli dalla polpa, quindi strofinati in modo da liberarli da ulteriori residui di polpa e conservati.

La sterilizzazione dei semi ha seguito il seguente protocollo: 2 minuti in alcool 70%, 20 minuti in NaOCl 2% e tre risciacqui in acqua. I semi sono stati posti su MS con 30 g saccarosio e 3,5 g/l di Phytagel. La germinazione è avvenuta nelle tre settimane successive. Le piantine caratterizzate da un asse cotiledonare assai lungo sono state poste in contenitori di vetro da 750 ml con MS, addizionato di 30 grammi di glucosio, 1 mg/l di BAP, 1 mg/l IBA e 3,5 g per litro dio di Phytagel. Il substrato dove erano state poste le piantine è indicato in bibliografia come idoneo per la proliferazione e radicazione delle varietà di fragole coltivate. Le piantine si sono ben accresciute in vitro pur non mostrando elevata proliferazione, che potrebbe essere accresciuta eliminando l’auxina (IBA) e/o innalzando il livello di BAP.

Sul muro perimetrale della chiesa di San Felice località di S. Anatolia di Narco è stata trovata una fragola apparentemente differente dalla specie selvatica, posta in vaso ha prodotto dei frutti con peduncolo molto raccorciato e dei pochi semi che sono stati raccolti solo uno ha germinato ed è stato posto in coltura differenziata sui medesimi terreni delle altre fragoline di bosco.

6. Giglio

Scheda Botanica

Lilium bulbiferum L. (Gigliacee). Pianta erbacea fornita di bulbo piccolo, bianco sporco. I fiori sono ermafroditi, eretti, campanulati a tepali scabri all’interno, soltanto curvati in fuori superiormente, di colore giallo arancione, inodori, in numero di 2-4 per pianta. Dotate di foglie alterne senza bulbilli nelle ascelle. Ovario infero dotato di tre logge con più ovuli formante una cassula a spigoli ottusi. È presente in boschi e prati fiorisce in Giugno Luglio, , è considerata specie protetta.

Lilium martagon L. (Gigliacee). Piante erbacea fornita di bulbo di 4-5 cm di diametro, di colore giallognolo e composto da scaglie appuntite. Pianta dotata di foglie inferiori subverticellate a 4-8 foglioline, le superiori sono sparse. I fiori presenti in numero variabile da 3 fina 20 sono pendenti, in un racemo lasso, di colore roseo - vinoso ed odorosi, i tepali sono arricciati all’infuori, punteggiati all’interno e lanuginosi sul dorso. L’ovario infero è dotato di tre logge con più ovuli. È presente in prati e boschi fiorisce in Luglio Agosto, è considerata specie protetta.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Semi ottenuti dall'impollinazione di un fiore di Lilium bulbiferum apertosi dopo il prelievo in campo e maturato nel corso del tempo in vaso

- Scaglie di bulbo ottenute da una pianta prelevata in località S. Anatolia di Narco in Giugno.

- Scaglie di bulbo prelevato in zona Valle Canatra sull’altopiano del Castelluccio.

Metodologie di sterilizzazione

I bulbi sono stati estratti dal terreno, lavati sotto acqua corrente in un capace contenitore per due ore. Le scaglie più esterne e più danneggiate da macchie o marciumi sono state eliminate; successivamente il bulbo è stato interamente ripulito, escludendo le scaglie più interne, in quanto troppo esili. Tale parte è stata ripiantata nel vaso con la terra di provenienza, per l’ulteriore sviluppo nella seguente stagione vegetativa. Tutte le scaglie sono state pulite sotto acqua corrente e pulite strofinando con le dita, successivamente poste in agitazione in acqua con Tween 20 e sterilizzate con bagno in alcool 70% per 2 minuti, in NaOCl per 20 minuti e sciacquate in acqua sterile per due ore. Ogni scaglia, considerata la crescita sotterranea del bulbo, è stata posta isolata in un tubo di vetro e lasciata li. Sono stati testati differenti terreni tutti addizionati con 2 ml/l di PPM. Ogni terreno aveva composizione differente: MS + 3% saccarosio, MS + 3% saccarosio + 0,2 mg/l NAA o 0,2 - 0,5 mg/l BAP. Tutti i terreni sono stati gelificati con Plant Agar 7 g/l.

Il Lilium martagon ha prodotto dopo 6-8 settimane bulbilli su terreno MS addizionato di 30 grammi di saccarosio, mentre sui terreni arricchiti della componente ormonale si sono formati pochi bulbilli. Il Lilium bulbiferum si è invece bel sviluppato in presenza di citochinine (0,2 mg/l).

Proliferazione

La bibliografia riporta dettagliatamente alcuni protocolli di coltura in vitro per il Lilium che, seppur validi per le varietà coltivate, sono meglio applicabili alle specie selvatiche.

I Bulbilli o le piantine formatesi sulle scaglie sono stati isolati con una porzione di scaglia e posti su terreno MS addizionato di 30 g di saccarosio, 0,01 mg/l NAA (acido naphtalen acetico) e posti in tubi per l’ulteriore sviluppo.

Tuttavia, adottando la concentrazione 1 mg/l, sono stati successivamente indotti superiori livelli di produzione di bulbilli.

Radicazione

Per quanto riguarda la radicazione, attualmente è stata riscontrata una certa capacità rizogena degli espianti, al termine della proliferazione. Tuttavia, a causa dell’evidente asincronia del fenomeno, si ritiene che siano necessari ulteriori ricerche, che abbiano come obiettivo quello di mettere a punto un protocollo di radicazione idoneo ad una più uniforme produzione di espianti radicati, al fine di renedere quanto più agevoli le successive operazioni di acclimatamento.

L’ovario impollinato e successivamente lasciato maturare ha prodotto solo tre semi pieni che però non hanno germinato anche se posti su apposito terreno di germinazione per embrioni di Lilium 1/2 MS + 30 grammi di saccarosio e 0,01 mg/l NAA. La germinazione di un seme è stata osservata in ottobre dopo quasi due mesi di coltura.

7. Epilobium

Scheda Botanica

Epilobium rosmarinifolium sin E. dodonaei Vill. (Enteracee) Piante erbacee con apparato radicale molto sviluppato. Fiori ermafroditi, in racemi di colore violetto. Semi contenuti in cassule dotati di un ciuffo di peli, fioritura in Luglio - Settembre.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- I Frutti raccolti in settembre sulle strade per Gavelli e Castelluccio in corrispondenza di tornanti ghiaiosi. I semi sono stati isolati dalle cassule quasi secche e prossime all’apertura, i semi involti in una peluria cotonosa sono stati isolati per sfregamento, e per peso differenziale sono stati eliminati i semi più leggeri. La germinabilità si è rilevata molto alta solamente per i semi prelevati a Gavelli.

Metodologie di sterilizzazione

I semi sono stati lavati in acqua per 30 minuti, sterilizzati in alcol 70% per 1 min., 20 minuti in NaOCl 2% e risciacquati tre volte in acqua; quindi sono stati posti su terreno di germinazione MS addizionato di 30 grammi di saccarosio, in cui hanno germinato nell’arco di 10 giorni. Trapiantati in vasetti con il medesimo terreno hanno continuato ad accrescersi velocemente.

Proliferazione

I primi tentativi di isolare i fusti dalle plantule hanno dato risultati incoraggianti; le piantine hanno continuato a proliferare sviluppando i germogli ascellari anche in assenza delle radici. Si tenterà di isolare i singoli internodi per verificare la possibilità di applicare il single node cutting per una più rapida clonazione.

8. Biancospino

Scheda Botanica

Crataegus oxycantha L. (Rosacee). Arbusto o arborescello spinoso, che si ritrova spesso isolato in siepi, boschi o macchie. Le foglie sono coriacee, obovate, più o meno cuneate 3-lobo e 3-fide. I fiori sono bianchi o rosei e appaiono in aprile – maggio, i frutti sono bacche coriacee con un singolo seme.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Rametti in crescita attiva raccolti in giugno luglio in località Gavelli.

- Semi raccolti in agosto sulla medesima pianta.

Metodologie di sterilizzazione

a) I rami in crescita sono stati posti in acqua e acido ascorbico (100 mg/L), durante il trasporto, lavati poi in laboratorio con acqua e alcune gocce di Tween e lasciati per 5 minuti in NaOCl 1%. I rametti sono stati posti su MS + 30 grammi di zucchero e 2 ml/l di PPM per un primo periodo. Alcuni rametti hanno iniziato ad accrescersi notevolmente anche sviluppando i germogli laterali, nel tempo però il fusticino ha iniziato a necrotizzare e tutti gli espianti che non si erano inquinati sono morti.

b) I semi sono stati trattati con acido cloridrico all’2 % per un ora, privati della polpa ed è stato estratto il seme dal nocciolo, che in seguito è stato sterilizzato per 2 min. in alcool 70%, 15 min. in NaOCl 2% e sciacquato in acqua sterile. Di tutti i semi alcuni, dopo quattro settimane, hanno mostrato germinazione, mentre alcuni sono stati oggetto di inquinamento batterico. Una parte dei semi è stata mantenuta a 4C° per una eventuale semina primaverile. Uno sviluppo ulteriore degli embrioni non è però stato osservato.

9. Bosso

Scheda Botanica

Buxus sempervirens L. (Bussacee). Arbusto sempreverde alto sino a 3 metri di legno duro con foglie subcoriacee, ovali brevemente picciolate lucide. I fiori sono sessili che appaiono in Marzo Aprile. I frutti sono cassule coriacee a tre logge fino a 6 semi neri bislunghi lucidi lanciati con forza fuori a maturità. Cresce in luoghi aridi e rocciosi.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Rami a riposo raccolti in marzo in località Castel San Felice in aprile.

- Rametti in crescita attiva raccolti in giugno - luglio in località Castel San Felice.

- Semi raccolti in agosto in località Castel San Felice.

Metodologie di sterilizzazione

a) Sia i rami a riposo che i rametti in crescita sono stati trattati in maniera simile. Inizialmente sono stati lavati sotto acqua corrente; successivamente, eliminate le foglie più basali lasciando un moncone di picciolo, gli espianti iniziali sono stati quindi posti in acqua distillata, arricchita di 100 mg/ di acido ascorbico e Tween, in agitazione per almeno 2 ore. Successivamente sono stati sciacquati in acqua distillata lavati in alcool al 70% per un minuto e posti in una soluzione al 1% di NaOCl ed una goccia di Tween 20 per 5 minuti in continua agitazione e sotto vuoto spinto. Poi sono stati lavati in acqua distillata sterile per due volte ed ivi lasciati in immersione per due ore. Sono stati quindi posizionati su terreno composto da MS (sali e vitamine), addizionato di zucchero (3%) ed addensato con 6 grammi di agar. Nel tempo si sono osservate una serie di contaminazioni fungine e batteriche, probabilmente dovute alla tomentosità invisibile che caratterizza i rami ancora verdi; la presenza di PPM nei terreni di coltura ha solamente rallentato la comparsa di sintomi aerei di contaminazione

b) I semi sono stati lavati per due ore in acqua e sterilizzati per 20 min. in NaOCl 2%; poi sono stati su terreno di germinazione pur non mostrando attività vegetativa. Un campione di semi prelevati in agosto presso il vivaio è stato mantenuto in frigorifero per una eventuale semina primaverile.

10. Rhamnus e Sorbo

Scheda Botanica

Rhamnus alpina L. (Ramnacee). Arbusto con fiori dioici foglie verdi con 7-20 nervature per lato. Fiorisce in Maggio Giugno e produce una drupa nera. Presente in boschi e rupi.

Pirus aria Ehrh. (Rosacee). Albero con prefogliazione conduplicata e foglie ovali semplici seghettate, niveo-tomentose piuttosto grandi. Fiori con petali bianchi in corimbi Frutti sono piccoli 10-12 mm eduli di forma subglobosa. Presente in boschi e rupi.

Espianti raccolti per la messa in coltura

- Di tutte e due le specie sono stati raccolti dei rami in aprile sul Castelluccio.

- In Agosto sono stati anche prelevati dei frutti maturi di Rhamnus.

- In aggiunta sono state prelevate delle plantule seminate presso il vivaio per la sterilizzazione di rami dell’anno.

Metodologie di sterilizzazione

Le gemme delle due specie sono state isolate dai rami con una porzione di ramo, poste in acqua e Tween per 30 min. e successivamente lavate in alcool 70% per 2 minuti, in NaOCl 2% per 20 minuti e successivamente lavate in acqua sterile per tre volte; le gemme sono state ripulite dalle perule più esterne e resinose e poste in terreno con WPM in presenza di 30 grammi di zucchero. Le gemme cosi trattate non germogliav